..

Celem projektu celu jest sprawdzenie skuteczności i bezpieczeństwa nowej kolumny – AM-03 stosowanej w połączeniu z plazmaferezą do usuwania z osocza krwi białka IL-6 (interleukina 6). Plazmafereza to standardowa procedura medyczna stosowana do bezpiecznego czasowego oddzielenia krwinek (elementy upostaciowane) od osocza (część płynna krwi) oraz ponownego ich połączenia oraz zwrotnego przetoczenia do pacjenta (w badaniu zwierzęcia). Celem tego czasowego oddzielenia jest usuwanie z osocza aktywnego białka IL-6, którego poziom w osoczu znacznie wzrasta w niektórych sytuacjach klinicznych – na przykład w stanie zapalnym; czasami -  jak np. w infekcji wirusem SARS-COV-2 wzrasta znacznie i jest odpowiedzialne za nasilanie się stanu zapalnego (tzw. „burzę cytokin”) prowadzącą do śmierci pacjenta. Kolumna AM-03 jest włączana w obieg osocza po oddzieleniu od krwinek i z wykorzystaniem reakcji immunologicznej w kolumnie (reakcja antygen-przeciwciało) w sposób swoisty wiąże cytokinę IL-6 przepływającą przez kolumnę skutecznie obniżając poziom tego białka w osoczu pacjenta.  Dla potwierdzenia skuteczności działania kolumny w zakresie usuwania IL-6 konieczne jest odtworzenie warunków klinicznych stanu zapalnego i sztuczne czasowe podniesienie poziomu IL-6 za pomocą indukcji zapalenia poprzez podanie dożylne standardowego bodźca jakim  LPS.

..

..

P-16 to białko kontrolujące starzenie się komórek poprzez zatrzymanie cyklu komórkowego. Na podstawie naszych wcześniejszych wyników badań (Ramisz i wsp., Ann Anatomy 2020) p 16 jest dobrym kandydatem na marker dysfunkcji gonad psów, zwłaszcza wnętrostwa lub guzów komórek germinalnych. Uzyskane wyniki będą podstawą do kolejnych publikacji oraz do przygotowania produktu w postaci testu taniego, szybkiego, łatwego i wiarygodnego do badania dysfunkcji jąder u psów w klinikach weterynaryjnych. W przypadku opracowania wstępnej wersji testu zakłada się, przygotowanie zgłoszenia patentowego. W przypadku osiągnięcia założonych celów, autorzy aplikacji we współpracy z podmiotami zewnętrznymi przygotują wnioski wdrożeniowe mające na celu przygotowanie i uruchomienie ciągłej produkcji opisanych szybkich testów diagnostycznych.

Nr rejestracyjny: 2019/33/B/NZ9/02159; Kierownik projektu: dr hab. Zbigniew Józef Arent

Leptospiroza jest chorobą o dużym znaczeniu zarówno jeśli chodzi o zdrowie ludzi jak i zwierząt, wywoływaną przez bakterie należące do rodzaju Leptospira . Obecnie uważana jest jako nowa lub ponownie pojawiąjąca się choroba zakaźne. Z powodu tych zakażeń każdego roku na całym świecie ponad milion przypadków ciężkiej leptospirozy jest rejestrowanych u ludzi, z których około 60 000 kończy się śmiercią. Leptospiroza jest również przyczyną dużych straty ekonomicznych,związanych głównie z zaburzeniami reprodukcyjnymi w hodowli bydła, owiec, świń i koni.Obecnie znamy wiele gatunków rodzaju Leptospira różniących się między sobą genetycznie, a także ponad 260 patogennych serowariantów różniących się budową powierzchniowych antygenów. Zdolność Leptospir do kolonizacji różnych nisz ekologicznych, na zewnątrz jak i wewnątrz organizmu gospodarza jest wynikiem różnorodnych procesów warunkowanych obecnością dużego genomu tych bakterii, umożliwiających ich adaptację i oporność na warunki stresowe.

Teoretycznie każdy patogenny serowariant Leptospira może zakażać wszystkie gatunki zwierząt Jednak w praktyce, każdy serowariant wykazuje wysoki stopień pasożytniczej adaptacji do naturalnego rezerwuaru zarazka. Oznacza to, że te mikroorganizmy można podzielić na dwie kategorie, które charakteryzuje pewien stopień pasożytniczej adaptacji do danego gospodarza, a mianowicie na zaadaptowane lub nie do konkretnego gospodarza. Istnieje wyraźny związek pomiędzy poszczególnymi serowariantami a żywicielami, czego klasycznym przykładam jest serowariant Icterohaemorrhagiae, który zaadoptowała się do szczura Rattus Norvegicus, czy też serowariant Hardjo zaadaptowany do bydła i owiec. Zakażenia zwierząt wywoływane przez serowarianty naturalnie do nich zaadaptowane powodują zazwyczaj przewlekły, bezobjawowy przebieg.

Natomiast zakażenia innych gatunków zwierząt i ludzi przez te same serowarianty, które nie wykazują żadnego stopnia adaptacji, określane są jako zakażenia przypadkowe i zazwyczaj maja przebieg bardziej ostry i nie doprowadzają do długiego nosicielstwa. Relacja gospodarz-pasożyt pomiędzy tymi patogenami Leptospira a gospodarzami, które pełnia role ich naturalny rezerwuarów albo ulegających przypadkowym zakażeniom nadal jest dużą zagadką. W ciągu ostatnich 15 lat nastąpił ogromny postęp w zrozumieniu całych genomów bakteryjnych. Porównawcza genomika patogennych i saprofitycznych szczepów Leptospira pozwoliła na zidentyfikowanie ponad 900 genów unikalnych tylko dla gatunków patogennych.

Geny te potencjalnie kodują białka związane z mechanizmami chorobotwórczości tych patogenów. Większość z nich to geny o całkowicie nieznanej funkcji. Brak homologów takich czynników chorobotwórczych wśród białek o znanej funkcji, sugeruje, że Leptospiry posiadają unikalne mechanizmy chorobotwórczości. W świetle tej wiedzy, porównanie genomów różnych patogennych gatunków Leptospira, w celu identyfikacji genów związanych z patogenezą choroby oraz z adaptacją do danego gospodarza, pozostaje kluczową luką w zakresie badań nad tymi patogenami i niewątpliwie pozostaje daleko w tyle za wieloma innymi patogennymi bakteriami. Wynika to głównie z braku odpowiednich narzędzi genetycznych, które są dostępne od dziesięcioleci dla innych gatunków bakterii. Aby zidentyfikować geny i białka, które ulegają ekspresji podczas zakażenia, planujemy przeprowadzić badania transkryptomiki, wykorzystując owce jako model zwierzęcy tych zakażeń.

Głównym celem projektu jest lepsze zrozumienie mechanizmów chorobotwórczych bakterii z rodzaju Leptospira poprzez identyfikacji genów biorących udział w mechanizmach adaptacji do gospodarza, stanowiących dla nich zarówno naturalny rezerwuar jak również ulegających zakażeniom przypadkowym. Adaptacja do gospodarza jest złożonym i dynamicznym procesem, którego nie można w pełni odtworzyć poza organizmem zwierzęcym. Cele te chcemy uzyskać poprzez zastosowanie sekwencjonowania transkryptomu trzech wybranych szczepów Leptospira (dwóch zaadaptowanych i jednego niezaadaptowanego do owiec) hodowanych zarówno w organizmie gospodarza oraz poza organizmem zwierzęcym na podłożach sztucznych. Oczekujemy, że porównanie wyników tych sekwencjonowań wskaże geny biorące udział w pokonywaniu barier patogen-gospodarz podczas procesu zakażenia. Poznanie czynników warunkujących te mechanizmy jest ważne do dalszego zrozumienia mechanizmów choroby i może przyczynić się do poznania lepszych metod zapobiegania tym zakażeniom.

Nr rejestracyjny: 2018/31/B/NZ6/02472; Kierownik projektu: prof. dr hab. Magdalena Strus

Bieżąca literatura medyczna szczególną uwagę zwraca ostatnio na wzajemną zależność pomiędzy stanem zdrowia człowieka, a składem mikrobioty przewodu pokarmowego. Ta dwukilogramowa masa bakteryjna, kolonizująca jelita dorosłego człowieka, może pełnić funkcję kolejnego, ludzkiego narządu wpływającego na zachowanie szczelności bariery jelitowej, funkcjonowanie układu immunologicznego, czy też regulację wielu procesów życiowych zachodzących w świetle jelita pod wpływem bakteryjnych metabolitów pohodowlanych. Drobnoustroje kolonizujące jelita człowieka są zaangażowane m.in. w metabolizm węglowodanów, aminokwasów, ksenobiotyków, wytwarzanie izoprenoidów i witamin.

Dlatego też jakościowe oraz ilościowe zmiany w prawidłowym składzie mikrobioty jelitowej muszą prowadzić do deregulacji wielu procesów życiowych zachodzących w świetle jelita włączając w to również
procesy karcynogenezy. Do substancji wytwarzanych przez mikrobiotę przewodu pokarmowego należą również witaminy głównie z grupy B oraz K2 (menachinon) które mogą być syntetyzowane bezpośrednio
w świetle przewodu pokarmowego, lub poza nim w trakcie fermentacji niektórych produktów spożywczych.

Witamina K2 obejmuje kilkanaście homologów, które w swojej budowie zawierają pierścień 2-metylo-1,4-naftochinonu i różnej długości łańcuchy boczne, przy czym bakterie kolonizujące ludzki przewód pokarmowy syntetyzują krótkołańcuchowe homologi tej witaminy ( n ≤ 7). Doustna suplementacja witaminą K2 odpowiada za zdrowe kości, zapobiega zwapnieniu naczyń krwionośnych i rozwojowi chorób układu krążenia. Przewiduje się też, że ze względu na obecność w budowie chemicznej tej witaminy pierścienia chinonu (czyli grupy funkcjonalnej występującej również w wielu chemioterapeutykach) może być stosowana w prewencji, a nawet w leczeniu wybranych chorób nowotworowych.

Wydaje się to wręczniemożliwe, a jednak w oparciu o wstępne badania in vitro przeprowadzone przez zespół japońskich naukowców na ludzkich liniach nowotworowych żołądka i wątroby wykazano pro-apoptotyczne działanie syntetycznego homologa K2-MK4, przy czym to działanie było silnie dawko-zależne. Stosunkowo mało poznanym jest homolog K2-MK7, który w największej ilości syntetyzowany jest naturalnie przez tlenowe laski Gram dodatnie, na drodze fermentacji różnych produktów spożywczych.
W oparciu o nasze wstępne badania przeprowadzone na ludzkiej linii nowotworowej (Caco-2) syntetyczna forma homologu K2-MK7 również wykazywała wyjątkowo silne pro-apoptotyczne działanie na komórki
nabłonka jelitowego, przy czym było to działanie powolne, nasilające się wraz z upływem czasu.

W naszym projekcie planujemy zatem sprawdzić jakie gatunki bakterii kolonizujące przewód pokarmowy zdrowego człowieka będą zdolne do produkcji największych ilości witaminy K2-MK7 na drodze fermentacji wybranych produktów (do tego badania wykorzystane zostanie metoda
woltamperometrii strippingowej oraz wysokosprawna chromatografia cieczowa HPLC). Ponadto w oparciuo linie nowotworowe ludzkiego nabłonka jelitowego, oraz linie makrofagowe zostaną przeprowadzone badania, których celem będzie poszukiwanie odpowiedzi na pytanie: czy naturalna forma witaminy K2- MK7 (pochodzenia bakteryjnego) będzie w porównywalny sposób jak jej syntetyczny homolog oddziaływała na zjawiska apoptozy, nekrozy, sekrecji prostaglandyn oraz cytokin odczynu zapalnego
(TNF-α, IL-6, IL-8, INF-γ, IL-12).

Następnie w oparciu o mysi model raka jelita grubego porównamy przeciwzapalne i antynowotworowe działanie syntetycznej formy K2-MK7 podanej drogą doustną, w stosunku do pofermentacyjnego ekstraktu zawierającego największe ilości naturalnej formy K2-MK7 wraz z probiotycznymi bakteriami przeprowadzającymi ten proces fermentacji.

Zaobserwowane zmiany w obrazie histopatologicznym jelita grubego oraz w stanie zdrowia zwierząt pozwolą odpowiedzieć na pytanie: czy w warunkach in vivo zaobserwujemy antynowotworowe działanie witaminy K2-MK7, oraz czy będą istniały biologiczne różnice pomiędzy syntetyczną, a naturalną formą K2-MK7.

Odpowiedzi na te pytania są w chwili obecnej bardzo istotne, gdyż obserwujemy lawinowy wzrost ilości spożywanej syntetycznej
formę witaminy K2-MK7.