Nr rejestracyjny: 2020/39/O/NZ9/00821; Kierownik projektu: dr hab. inż. Artur Gurgul

W ostatnich latach na rynku polskim i rynkach światowych nastąpił lawinowy wzrost produkcji i sprzedaży produktów kosmetycznych, spożywczych i medycznych oraz suplementów diety zawierających jako składnik aktywny kanabidiol. Kanabidiol (CBD) to fitokannabinoid pochodzący z gatunku konopi (głównie Cannabis sativa), który jest pozbawiony działania psychoaktywnego i może być legalnie uprawiany w polskich i unijnych warunkach prawnych. Jego nie do końca udowodnione działanie na organizm człowieka ma charakter przeciwbólowy, przeciwdrgawkowy, zwiotczający mięśnie, przeciwlękowy oraz przeciwpsychotyczny. CBD wykazuje także działanie neuroprotekcyjne, przeciwzapalne i przeciwutleniające. Mimo że brak jest unijnych przepisów dopuszczających CBD do spożycia przez ludzi, praktyczne dowody wskazują, że jest ono szeroko stosowane przez różne grupy społeczne w Polsce, od młodzieży po starszych pacjentów z poważnymi problemami zdrowotnymi. CBD znajduje także potencjalnie zastosowanie w medycynie weterynaryjnej, przede wszystkim w terapii bólu, stanów zapalnych i napięcia nerwowego u zwierząt domowych, jak również leczeniu napadów padaczkowych obserwowanych u psów i koni. Na poziomie molekularnym, działanie CBD na komórki żywe nie jest wystarczająco poznane. Wiadomo, że oddziałuje on poprzez szereg receptorów komórkowych, jednak działanie to ma często charakter modulacyjny o niejasnym mechanizmie. Istnieje również bardzo ograniczona liczba dowodów (badania w modelu in vitro) opisujących wpływ CBD na zmiany w globalnym transkryptomie komórek, będącym najważniejszym efektorem, mediatorem i regulatorem cyklu, metabolizmu i różnicowania żywych komórek.

Aby przedstawić wpływ CBD na żywy organizm w możliwie najbardziej kompleksowy sposób, w tym projekcie planujemy wykorzystać podejście wysokowydajnego sekwencjonowania RNA za pomocą techniki następnej generacji (RNA-Seq) do opisania wpływu CBD na zmiany w transkryptomie takich narządów jak: mózgowie, śledziona i wątroba, w standardowym, mysim modelu. Narządy zostały dobrane tak, aby uwzględnić obserwowany wpływ CBD na układ nerwowy i układ odpornościowy oraz aby ocenić potencjalnie toksyczny wpływ jego metabolizmu na wątrobę. Eksperyment uwzględnia również takie aspekty jak: dawkowanie i czas podawania CBD. Zastosowane podejście RNA-Seq, pozwoli na obiektywną obserwację końcowego efektu CBD na ekspresję genów w analizowanych tkankach, bez koniczności czynienia wstępnych założeń czy testowania postawionej a priori hipotezy badawczej. Wyniki pomogą w pełni rozpoznać mechanizm działania CBD i pozwolą zidentyfikować prawdziwe efektory podawania CBD w organizmie zwierząt.

Otrzymane wyniki RNA-Seq, uzupełnione o badania behawioralne i biochemiczne (poziomy Il- 1 beta, IL-6, TNF alfa oraz kortykosteronu) pozwolą wypełnić istniejącą lukę w wiedzy na temat zmian, jakie CBD wywołuje w transkryptomie narządów i tkanek docelowych oraz zapewnią globalną, obiektywną i porównawczą charakterystykę wpływu konsumpcji CBD na żywe komórki i narządy. Pozwolą również na utworzenie kompleksowej listy genów, na które wpływa CBD oraz skonstruowanie wiarygodnych mechanizmów oddziaływania CBD jako biologicznie aktywnej cząstki. Otrzymane wyniki pozwolą także na ocenę potencjalnej skuteczności i przydatności CBD w leczeniu rozmaitych schorzeń u zwierząt domowych i hodowlanych. Dostarczą także podstaw do głębszego zaangażowania polskiego rolnictwa w uprawę konopi dla celów produkcji zwierających kanabidiol leków i suplementów żywieniowych dla zwierząt gospodarskich.

Nr rejestracyjny: 2020/39/B/NZ9/00865; Kierownik projektu: dr hab. inż. Konrad Ocalewicz

Streszczenie popularno-naukowe

Identyfikacja genów wpływających na skuteczność gynogenezy pstrąga tęczowego (Oncorhynchus mykiss)

Rozród płciowy jest najbardziej powszechnym sposobem rozmnażania wśród zwierząt. Proces ten polega na wytwarzaniu przez osobniki różnych płci haploidalnych samczych i samiczych gamet oraz ich fuzji, w wyniku której powstaje diploidalna zygota. Rozwijający się organizm potomny zawiera geny obojga rodziców. Specyficzną formą rozmnażania płciowego jets procesy gynogenezy. Gynogenezę, czyli rozwój organizmu, którego genom składa się tylko z matczynego DNA opisano     u nielicznych gatunków bezkręgowców, ryb i płazów.

Gynogenetyczny rozwój zarodków zwierząt kręgowych można indukować w warunkach kontrolowanych. Proces gynogenezy u ryb uzyskuje się aktywując komórki jajowe napromieniowanymi plemnikami. Haploidalny zestaw matczynych chromosomów jest podwajany poprzez zatrzymanie pierwszego podziału komórkowego w zarodku. W tym celu, w ściśle określonym momencie po zakończeniu procesu replikacji DNA, ale jeszcze przed kariokinezą, haploidalne zarodki poddawane są działaniu udaru środowiskowego, na przykład wysokiego ciśnienia hydrostatycznego lub subletalnych temperatur, co prowadzi do depolimeryzacji mikrotubul wrzeciona podziałowego i udaremnia segregację chromosomów oraz podział jądra komórkowego. W efekcie powstają w pełni homozygotyczne zarodki nazywane gynogenetycznymi podwojonymi haploidami (ang. Doubled Haploids). gynogenetyczne DH zarodki ryb znajdują zastosowanie w badaniach dotyczących fenotypowych konsekwencji występowania recesywnych alleli, funkcji poszczególnych genów czy genetyki nowotworów. Ponadto podwojone haploidy są szczególnie przydatne w badaniach z zakresu mapowania   genów   i   sekwencjonowania   genomów.   Proces   gynogenezy    wykorzystuje   się    w programach selekcyjnych do produkcji jednopłciowych stad ryb i osobników o pożądanych cechach hodowlanych. Niestety, poważnym ograniczeniem indukowanej gynogenezy ryb jest jej mała skuteczność. Niewiele gynogenetycznych osobników wykluwa się i dożywa do stadium samodzielnego pobierania  pokarmu  (około  15%),  a tylko  pojedyncze  ryby  dojrzewają  płciowo.

Za niską skuteczność gynogenezy odpowiedzialne są przede wszystkim ujawniające się allele recesywne. Jednak wyniki ostatnich badań prowadzonych przez autorów niniejszego projektu pokazały, że komórki jajowe niektórych samic pstrąga tęczowego charakteryzują się znacząco wyższym potencjałem jeżeli chodzi o skuteczność procesu gynogenezy. Analiza matczynego RNA w gametach o różnym potencjale gynogenetycznego rozwoju wykazała istotne różnice w ekspresji kilkudziesięciu genów związanych między innymi z takimi procesami jak wczesny rozwój embrionalny, migracja i różnicowanie się komórek, metabolizm triglicerydów, biosynteza wielonienasyconych kwasów tłuszczowych czy starzenie się.

Celem niniejszego projektu jest znalezienie genów, których ekspresja predestynuje oocyty do gynogenetycznego rozwoju. Badania prowadzone będą z wykorzystaniem technologii RNA-seq na oocytach wyprodukowanych przez kilkanaście samic. Wyniki dodatkowo będą weryfikowane przy pomocy metody q-PCR. Wiemy już, że oocyty produkowane przez różne samice mają różny potencjał do gynogenetycznego rozwoju. Teraz musimy znaleźć genetyczne różnice pomiędzy takimi komórkami. Znalezienie genów, których ekspresja wpływa na skuteczność gynogenezy pozwoli opracować markery genetyczne umożliwiające wytypowanie do zabiegu gynogenezy samic, których ikra będzie miała wysoki potencjał rozwojowy. Tym samy zwiększymy skuteczność całego procesu i spowodujemy, że gynogeneza stanie się realnym narzędziem w badaniach z zakresu biologii rozrodu oraz podczas produkcji homozygotycznych i klonalnych linii pstrąga tęczowego. Realizacja tych badań pozwoli także na lepsze zrozumienie molekularnych podstaw różnych form rozrodu płciowego kręgowców.